Достижение сверхвысокой чувствительности при тестировании на эстроген: руководство по точному измерению для особых групп населения с низким уровнем гормонов

Оглавление

• Ключевые моменты
• Почему важно измерение эстрогена
• Как эстрогены обрабатываются в организме
• Особая проблема: группы населения с очень низким уровнем эстрогена
• Метод золотого стандарта: жидкостная хроматография–масс-спектрометрия
• Подготовка образца: подготовка к анализу
• Дериватизирование: повышение чувствительности с помощью химии
• Хроматографическое разделение: различение похожих молекул
• Матричные эффекты: скрытая проблема интерференции
• Клинические последствия: что это значит для пациентов
• Ограничения текущего подхода
• Рекомендации для исследователей и клиницистов
• Часто задаваемые вопросы
• Информация об источнике

Ключевые моменты

• Старые иммуноанализы на эстроген часто давали неточные показания из-за перекрёстной реактивности с похожими молекулами.
• Современный метод разбавления стабильными изотопами в сочетании с жидкостной хроматографией–масс-спектрометрией является золотым стандартом для измерения эстрогена.
• У женщин в постменопаузе и у пожилых мужчин уровень эстрогена часто составляет менее 5 пг/мл, что требует использования ультрачувствительных методов.
• Метод с дериватизацией NMPS требует всего 0,1 мл сыворотки и позволяет измерять пять видов эстрогенов с высокой чувствительностью.
• Загрязнение от лабораторных материалов, таких как стеклянные пробирки, может ложно завышать результаты анализа на эстроген, поэтому его необходимо контролировать.

Зачем важен анализ на эстроген

Измерение уровня эстрогена является краеугольным камнем современной эндокринологии. Оно играет критическую роль в клинической оценке многих эндокринных (связанных с гормонами) заболеваний, а также в исследованиях, изучающих влияние гормонов на биологию человека и развитие болезней. На протяжении почти 30 лет ученые и клиницисты полагались на традиционные радиоиммуноанализы (РИА) или прямые ферментные иммуноанализы для измерения циркулирующего уровня эстрогена.

Эти старые методы обеспечивали хорошую чувствительность, но имели серьезный недостаток: отсутствие специфичности. Антитела, используемые в иммуноанализах, часто проявляют перекрёстную реактивность с другими стероидами — молекулами, химически схожими с эстрогенами, что приводит к неточным показаниям. Эта перекрёстная реактивность вызывала значительные проблемы при интерпретации данных эпидемиологических исследований, а результаты часто варьировались от одной лаборатории к другой.

Еще одним существенным ограничением методов на основе иммуноанализа является то, что они позволяют измерять только один аналит за раз. Чтобы измерить все метаболиты (продукты распада) одного эстрогена, исследователям приходится проводить множество отдельных анализов, что занимает много времени и неэффективно. Однако за последнее десятилетие значительный прогресс в технике, называемой разбавлением стабильными изотопами (SID), в сочетании с жидкостной хроматографией–отбором реакционных переходов–масс-спектрометрией (LC-SRM/MS), предложил мощное решение этих проблем.

Однако даже при наличии этой передовой технологии остается сложная задача: количественное определение эстрогенов и их метаболитов в образцах сыворотки и плазмы у популяций с экстремально низким уровнем эстрогена. Сюда входят пожилые мужчины, дети, женщины в постменопаузе и женщины, получающие ингибиторы ароматазы для лечения рака молочной железы. В этом обзоре, подготовленном исследователями из Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета и Пекинского института радиационной медицины, рассматриваются особые проблемы, связанные с использованием методологии ультравысокочувствительного SID LC-SRM/MS для таких сложных образцов, и предлагаются лучшие практики на каждом этапе аналитического процесса.

Как эстрогены обрабатываются в организме

Понимание поведения эстрогенов в организме помогает объяснить, почему их измерение так важно. Множество клинических и экспериментальных исследований показали, что относительно высокий уровень эстрогена в крови женщин связан с повышенным риском развития рака молочной железы, рака эндометрия и рака яичников — хотя примечательно, что многие из этих исследований использовали радиоиммуноанализы (РИА) сомнительной достоверности. У мужчин повышенный циркулирующий уровень эстрогенов также является потенциальным фактором риска рака предстательной железы.

Способность точно измерять эстрадиол (E2) и тестостерон (T) у детей оказалась критически важной для диагностики и лечения нарушений пубертата и полового развития. Некоторые исследования также показали, что более высокий уровень эстрогена в более раннем возрасте коррелирует с началом развития молочных желез у девочек, что предполагает, что гормоны в период развития могут модулировать риск заболеваний в более позднем возрасте.

Эстрогены действуют через два основных пути: механизмы, зависимые от рецептора эстрогена (ER), и независимые от него. Путь, зависимый от ER, включает прямую стимуляцию аномальной пролиферации клеток, которая причинно связана с развитием рака молочной железы. Считается, что канцерогенные (вызывающие рак) эффекты, не зависящие от ER, происходят через действие гено токсичных — повреждающих ДНК — метаболитов эстрогена.

Вот как работает этот процесс:

1. Материнские эстрогены подвергаются окислительному метаболизму (химической модификации ферментами) с участием ферментов цитохрома P450 (CYP) 1B1 и CYP3A4.
2. Этот процесс образует два типа катехоловых метаболитов эстрогена (химическая структура с двумя соседними гидроксильными группами): 2,3-катехолы (2-OH-E1 и 2-OH-E2) и 3,4-катехолы (4-OH-E1 и 4-OH-E2).
3. CYP1B1 демонстрирует значительную региоселективность — предпочтение в соотношении 9:1 — для образования 4-OH-E1 и 4-OH-E2 по сравнению с 2-гидроксилированными формами.
4. Исследования показывают, что 4-OH-E1 и 4-OH-E2 более гено токсичны (повреждают ДНК), чем соответствующие метаболиты 2-OH-E1 и 2-OH-E2.

Интересно, что не все метаболиты эстрогена вредны. 2-OH-E2 является мощным ингибитором ароматазы (фермента, который превращает андрогены в эстрогены), а 2-OH-E1 связан со снижением риска эстроген-рецептор-положительного (ER+) рака молочной железы у женщин в постменопаузе после поправки на концентрации циркулирующего эстрона (E1). Оба катехола быстро превращаются ферментом, называемым катехол-O-метилтрансферазой (COMT), в метокси (OMe) метаболиты. Примечательно, что 2-OMe-E2 обладает значительной антипролиферативной активностью, то есть помогает предотвращать неконтролируемое размножение клеток.

Эстрогены и их гидрокселированные метаболиты также легко модифицируются путем присоединения групп глюкуронида, сульфата или глутатиона (GSH), образуя конъюгированные метаболиты эстрогена. Наиболее распространенными циркулирующими конъюгатами эстрогена являются сульфаты, которые могут служить предшественниками эстрогена в ткани молочной железы благодаря действию стероидных сульфатаз. Циркулирующие андрогены также могут служить предшественниками эстрогена у женщин в постменопаузе благодаря действию ароматазы — обеспечивая принципиально иной источник эстрогенов по сравнению с женщинами в пременопаузе.

Из-за этих разнообразных эффектов и метаболических путей эстрогены и их метаболиты в кровотоке являются ценными биомаркерами — биологическими индикаторами — биосинтеза и метаболизма эстрогена в тканях.

Особая проблема: популяции с крайне низким уровнем эстрогена

У большинства взрослых людей в репродуктивном возрасте уровень эстрогена достаточно высок для измерения стандартными методами. Однако определенные группы представляют собой серьезную аналитическую проблему из-за их чрезвычайно низкого уровня эстрогена.

Типичные концентрации несвязанного E2 в сыворотке крови у женщин в постменопаузе и пожилых мужчин часто составляют менее 5 пг/мл (пикограмм на миллилитр — один пикограмм равен одной триллионной доле грамма). Для сравнения: уровни несвязанного E1 у этих групп варьируются от 11,8 до 37,4 пг/мл. В клинических исследованиях по детской эндокринологии сообщалось, что уровни E2 примерно в 100 раз ниже, чем у взрослых, а самые низкие уровни наблюдаются в препубертатном периоде (до начала полового созревания).

Такие низкие концентрации в пг/мл представляют огромную сложность для большинства анализов на основе ЖХ-МС. Кроме того, другие несвязанные метаболиты эстрогенов — такие как метоксиэстрогены (MeO-эстрогены) или катехолы — присутствуют в еще более низких концентрациях, как правило, ниже нижнего предела количественного определения (LLOQ, наименьшее количество, которое можно надежно измерить) большинства стандартных анализов ЖХ-МС.

Проблема чувствительности в первую очередь обусловлена низкой эффективностью ионизации несвязанных эстрогенов и их метаболитов — то есть они не легко приобретают электрический заряд, необходимый для их обнаружения масс-спектрометрией. Именно поэтому ученые разработали множество стратегий дериватизации (химических модификаций) для улучшения ионизации и повышения чувствительности. Эти стратегии также часто способствуют очистке образца.

На самом деле измерить общий уровень эстрогенов (несвязанных и связанных форм) после гидролиза или сольволиза (химического расщепления с использованием воды или спирта) легче, поскольку общий уровень эстрогенов как минимум в 2–3 раза выше, чем уровень несвязанных эстрогенов. Однако оценка эффективности и однородности гидролиза между образцами остается проблематичной и может приводить к ошибочным результатам, так как аутентичные стандарты и стандарты со стабильными изотопами не всегда доступны для всех конъюгатов эстрогенов.

Золотой стандарт метода: жидкостная хроматография — масс-спектрометрия

Методология стабильноизотопного разбавления (SID), объединенная с жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией в режиме отобранных реакций (ЖХ-SRM/MS), теперь широко признана «золотым стандартом» для количественного определения эстрогенов и их метаболитов в сыворотке и плазме крови. По сравнению с иммуноанализами этот подход обеспечивает повышенную специфичность, высокую точность и возможность одновременного мониторинга нескольких эстрогенов.

Принцип работы заключается в следующем: исследователи добавляют известное количество «тяжелой» (меченой изотопом) версии каждого эстрогена в образец пациента. Поскольку меченые и немеченые формы ведут себя идентично при экстракции и анализе, исследователи могут рассчитать точное количество природного эстрогена, сравнивая два сигнала. Этот самокорректирующийся подход устраняет многие ошибки, присущие более старым методам.

Сверхвысокая чувствительность может быть достигнута, когда молекулы эстрогенов преобразуются в «предварительно ионизированные» дериваты (химически модифицированные формы, которые уже несут заряд), и анализируются с помощью тройных квадрупольных масс-спектрометров в режиме отобранных реакций (SRM), в сочетании с нанопроточной жидкостной хроматографией (методом, использующим чрезвычайно малые скорости потока).

Два знаковых метода демонстрируют мощь этого подхода:

• 2011 год — метод деривата GP (Girard P): Используется для анализа E1 и его метаболитов. Позволил исследователям использовать всего 0,5 мл сыворотки. Нижний предел количественного определения для каждого эстрогена составил 0,156 пг/мл (15,6 фемтограмм [фг] на колонке) — фемтограмма равна одной квадриллионной доле грамма.
• 2015 год — метод деривата N-метилпиридиний-3-сульфонил (NMPS): Используется для E2 и его метаболитов. Требовал всего 0,1 мл сыворотки — одну каплю — но обеспечил поразительную чувствительность 1,0 фг на колонке для пяти эстрогенов и их метаболитов.

Подготовка образца: подготовка к анализу

Прежде чем можно будет провести измерение уровня эстрогена, образец должен быть подготовлен. Это обычно включает экстракцию (разделение эстрогенов с другими компонентами крови), очистку и концентрирование. Существуют два основных подхода к обработке конъюгированных эстрогенов: их можно расщепить до несвязанных форм путем гидролиза перед анализом, либо измерять в виде intact-конъюгатов.

Гидролиз преобразует конъюгаты в несвязанные формы, что увеличивает их концентрацию в образце. После гидролиза жидкостно-жидкостная экстракция (LLE) или твердофазная экстракция (SPE) могут эффективно извлекать эстрогены из сыворотки и плазмы крови.

Жидкостно-жидкостная экстракция (LLE): LLE недорога, быстра и часто является основным методом экстракции для анализа эстрогенов. Ее недостатки включают трудоемкость, затратность по времени и сложность автоматизации по сравнению с SPE. Наиболее часто используемыми растворителями являются метил-трет-бутиловый эфир (MTBE), диэтиловый эфир, дихлорметан или смеси органических растворителей. MTBE может извлекать как несвязанные эстрогены из сыворотки, так и дериваты эстрогенов из буфера дериватизации.

Тщательное исследование Кески-Рахконена и коллег сравнило эффективность экстракции MTBE, диэтилового эфира, гексана и 2-метилбутана из образцов сыворотки. Исследование показало, что LLE с MTBE полностью восстанавливает протестированные стероидные гормоны, в отличие от других растворителей, что делает его предпочтительным выбором.

Твердофазная экстракция (SPE): Офф-лайн или он-лайн SPE, объединенная с ЖХ-МС, является очень перспективной техникой для полуавтоматического анализа образцов. Преимущества он-лайн SPE включают сокращение времени анализа, более концентрированные хроматографические пики и значительно сниженный риск загрязнения.

Одно из заметных исследований Чжао и коллег описало метод ЖХ-МС для определения 12 несвязанных эстрогенов и их intact-конъюгатов в крови и моче. Этот метод использовал всего один этап SPE как для несвязанных эстрогенов, так и для их конъюгатов: после загрузки образцов на картридж Oasis HLB (баланс гидрофильности-липофильности) несвязанные эстрогены сначала элюировались этилацетатом, а затем конъюгаты элюировались метанолом, содержащим 0,1% гидрата аммиака.

Более недавнее исследование сообщило об автоматизированном онлайн-процессе захвата и элюирования с использованием колонки-ловушки из материала с ограниченным доступом (RAM) со слабой катионитовой обменной смолой (WCX) и онлайн-разбавлением. Этот подход демонстрирует потенциал для использования с образцами от пожилых мужчин, детей и женщин в пременопаузе, поскольку упрощенная процедура требует только 100 мкл сыворотки, обеспечивает LLOQ на уровне 3 пг/мл и предоставляет отличную точность и прецизионность.

Два подхода для конъюгированных эстрогенов:

Первый подход включает гидролиз β-глюкуронидных и сульфатных конъюгатов перед экстракцией и дериватизацией. Наиболее часто используемым ферментом является β-глюкуронидаза/арилсульфатаза, очищенная из улитки Helix pomatia. Этот фермент естественно содержит как β-глюкуронидазную, так и сульфатазную активности в почти равных количествах. В отличие от этого, фермент из E. coli содержит только β-глюкуронидазу и практически лишен сульфатазной активности.

Однако исследователи должны проявлять осторожность: доказательства показывают, что экстракт Helix pomatia загрязнен 3β-гидроксистероиддегидрогеназой (HSD) или активностью холестериноксидазы. Это может затруднить исследования, в которых целевыми аналитами являются субстраты 3β-HSD — очень важный вопрос, если андрогены анализируются в той же пробе.

Эксперименты с синтезированными конъюгатами сульфатов эстрогенов выявили еще одно критическое ограничение: только 3-сульфатная форма расщепляется ферментативным гидролизом; 17-сульфатная группа устойчива. Многообещающей альтернативой является сольволиз конъюгатов с использованием безводного метанольного хлороводорода — подход, впервые опубликованный Тангом и Кроуном в 1989 году и впоследствии использованный несколькими исследовательскими группами. Удивительно, но этот метод, по-видимому, не применялся к образцам сыворотки и плазмы от пожилых мужчин, детей и женщин в пременопаузе.

Второй подход включает анализ неповрежденного конъюгата методом масс-спектрометрии в отрицательном ионном режиме, без ферментативного гидролиза или дериватизации. Недавние исследования показали, что общая концентрация E1 у женщин в пременопаузе варьируется от 61,3 до 442,1 пг/мл, включая сульфат E1 со средней концентрацией 244,8 пг/мл. Эти более высокие уровы глюкуронида E1 или сульфата E1 могут быть относительно легко количественно определены с помощью ЖХ-МС. Сульфат E1 в сыворотке можно эффективно экстрагировать с помощью картриджей Oasis HLB или слабой анионитовой обменной смолы (WAX) и элюировать ацетатом аммония или гидроксидом аммония.

Этот подход с неповрежденными конъюгатами многообещающ, но сталкивается со значительным препятствием: отсутствием подлинных стандартов конъюгатов эстрогенов и тяжелых стабильных изотопных аналогов для использования в качестве внутренних стандартов. Например, коммерчески доступен только один из пяти возможных сульфатов E2 (3-сульфат, 17-сульфат, 3-сульфат 17-глюкуронид, 3-глюкуронид 17-сульфат и 3,17-бис-сульфат): 17β-E2-2,4,6-[²H]₄-3-сульфат.

Дериватизация: повышение чувствительности с помощью химии

Поскольку неконъюгированные эстрогены присутствуют в крови пожилых мужчин, детей и женщин в пременопаузе в столь экстремально низких концентрациях, надежное измерение в настоящее время требует дериватизации — присоединения химической группы к молекуле эстрогена для улучшения ее способности обнаруживаться. Для этой цели было разработано множество химических реагентов для дериватизации, нацеленных на фенольную гидроксильную группу (реакционноспособная группа -OH, прикрепленная к ароматическому кольцу) молекул эстрогена.

Сообщаемые реагенты для дериватизации включают:

• Пентафторбензил (PFB)
• Пиридил-3-сульфонил (PS)
• Дансил (D)
• 2-Пиколиноил (P)
• N-метил-2-пиридил (NMP)
• N-метилникотиноил (NMN)
• 1-(2,4-динитро-5-фторфенил)-4,4-диметилпиперазинил (MPPZ)
• 3-пентафторбензил-17β-пиридиний (PFBPY)
• 1,2-диметилимидазол-5-сульфонилхлорид (DMIS)

Большинство этих дериватов (PFB, PNB, PS, D и P) не несут электрического заряда на молекуле, что ограничивает их способность достигать пределов обнаружения на уровне пг/мл. Кроме того, поскольку эстрогены химически похожи друг на друга, эти дериваты склонны образовывать неспецифические паттерны фрагментации, что приводит к плохой аналитической специфичности.

Производные, несущие постоянный заряд — MP, NMN, MPPZ, PFBPY и DMIS — гораздо лучше подходят для достижения чувствительности на уровне пг/мл. Однако самым мощным подходом на сегодняшний день стал метод собственной лаборатории авторов: производное NMPS (N-метилпиридиний-3-сульфонил). Этот процесс преионизационного дериватизации превращает E2 и его метаболиты в молекулы с постоянным зарядом. При нижнем пределе количественного определения 1,0 фг на колонке при объеме инъекции 1 мкл он обеспечивает абсолютное количественное определение неконъюгированных эстрогенов в образцах сыворотки крови у женщин в постменопаузе и пожилых мужчин. Поскольку дериватизация происходит в фенольной гидроксильной группе — свойстве, общем для всех эстрогенов, — этот метод может быть обобщен для измерения всех эстрогенов.

При любом анализе с высокой чувствительностью исследователи должны проявлять крайнюю осторожность. Крошечные количества загрязнений, перенос материала от предыдущей инъекции или фоновые помехи от расходных материалов обработки могут ухудшить качество данных. Особое важно использовать подходящую матрицу-пустышку (образец без эстрогенов) для проверки фонового сигнала системы, исходящего от пробирок, экстракционных растворителей, буферов для дериватизации и самого прибора.

Это не теоретическая проблема. В ходе своей работы авторы неожиданно обнаружили, что некоторые стеклянные пробирки вызывали помехи в сигнале E2, эквивалентные примерно 10 пг/мл в сыворотке во время ферментативного гидролиза — количество, достаточное для полной недействительности результатов в популяции, где нормальные уровни E2 составляют менее 5 пг/мл.

Хроматографическое разделение: Различение похожих молекул

При количественном определении эстрогенов на основе ЖХ-СРМ/МС помехи, возникающие от изобарных соединений — молекул с той же массой, которые не являются целевым эстрогеном, — могут быть критической проблемой. Эти изобарные помехи могут поступать из экзогенных источников (вне организма) или от эндогенных соединений (естественно присутствующих в организме), включая другие стероиды.

К сожалению, эстрогены и их метаболиты склонны образовывать похожие продуктивные ионы при фрагментации в тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Например, при анализе производных дансила часто выбирается продуктивный ион m/z 171 (определенное отношение массы к заряду) как количификатор или квалификатор для всех эстрогенов и их метаболитов, поскольку он происходит от самой группы дансила. Эта универсальность становится проблемой: если E1 и его метаболиты не разделены хроматографически от E2 и его метаболитов, может произойти завышение количественного определения свободного E2 — особенно учитывая, что концентрация свободного E1 обычно в 2–3 раза выше, чем у E2.

Еще более сложной задачей является точное количественное определение индивидуальных изомеров катехоловых эстрогенов — конкретно 2- и 4-OH-E1, 2- и 4-OH-E2 и их соответствующих метокси-метаболитов — поскольку эти изомеры чрезвычайно похожи по структуре и должны быть разделены друг от друга хроматографически.

Исследователи разработали несколько стратегий для решения этой проблемы:

• Увеличение пиковой емкости (способности разделять множество соединений за один запуск)
• Оптимизация градиентного элюирования (постепенное изменение состава растворителя во времени)
• Использование частиц неподвижной фазы меньшего размера — все чаще используются частицы размером менее 2 мкм для улучшения хроматографической емкости, чувствительности и скорости анализа.

В качестве примера в недавнем исследовании авторов 12 метаболитов эстрогенов были успешно разделены на колонке Waters BEH130 C18 (150 мкм × 100 мм, 1,7 мкм, 130 Å) в течение 45 минут после пиридинийсульфонильной дериватизации. Включая четыре катехоловых эстрогена (4-OHE1, 2-OHE1, 4-OHE2, 2-OHE2) и четыре MeO-эстрогена (4-MeOE1, 2-MeOE1, 4-MeOE2, 2-MeOE2).

Эффекты матрицы: Скрытая проблема помех

Человеческая сыворотка и плазма представляют собой сложные биологические смеси. Они содержат такие компоненты, как фосфолипиды и соли, которые могут либо усиливать, либо подавлять эффективность ионизации эстрогенов — то есть они могут делать сигнал эстрогена сильнее или слабее, чем он должен быть. Эти «эффекты матрицы» были названы потенциальным «ахиллесовой пятой» анализа биологических образцов на основе ЖХ-МС/МС.

В особенно тревожном открытии Кески-Рахконен и коллеги столкнулись с эффектами матрицы, когда анализы на основе ЖХ-МС проводились в пробирках или планшетах из пластика — распространенном лабораторном материале, который может вносить непредвиденную вариабельность.

Одна из тонких опасностей: соэлюирующие соединения (вещества, выходящие из хроматографической колонки в то же время, что и целевой эстроген) не всегда могут быть видны в контролируемых диапазонах или переходах. Это явление известно как «призрачные пики» — невидимые помехи, которые могут тихо искажать результаты.

Для анализа эстрогенов ионизация электрораспылением (ESI) в положительном режиме является наиболее широко используемым методом ионизации после дериватизации. Однако было высказано мнение, что ESI более подвержена подавлению ионов, чем химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). Интересно, что исследования показали, что недериватизированный E2 имел как минимум 10-кратное увеличение чувствительности в отрицательном режиме ESI по сравнению с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI) в положительном режиме и не страдал от помех со стороны соэлюирующих изобарных соединений.

Существуют три общие стратегии оценки эффектов матрицы:

1. Постколонная инфузия: Непрерывная инфузия аналита в масс-спектрометр во время инъекции образца пустой матрицы для наблюдения за изменениями сигнала.
2. Постэкстракционное добавление: Добавление известного количества аналита к экстрагированной пустой матрице и сравнение с чистым раствором.
3. Сравнение наклонов калибровочных кривых: Сравнение наклона калибровочной кривой, подготовленной в матрице, с наклоном кривой, подготовленной в чистом растворе.

Согласно руководству FDA 2013 года, следует предпринять соответствующие меры для обеспечения отсутствия матричных эффектов на всех этапах применения метода, особенно если матрица, используемая для производственных партий, отличается от матрицы, применявшейся при валидации метода. Критерии приемлемости требуют, чтобы измеренное значение находилось в пределах 15% смещения от номинального значения, а коэффициент вариации (CV, мера разброса результатов) должен быть менее 15%.

Существует несколько подходов, позволяющих снизить матричные эффекты при количественном определении эстрогена:

• Улучшение процедуры пробоподготовки
• Оптимизация хроматографического разделения
• Применение внутренних стандартов, меченных стабильными изотопами

Даже внутренние стандарты требуют тщательного рассмотрения. Исследователям следует проявлять осторожность при использовании внутренних стандартов в виде [²H]-аналогов (меченых дейтерием), поскольку сдвиг времени удерживания между немечеными и мечеными дейтерием соединениями может иметь аналитическое значение — это приводит к дифференциальному подавлению сигналов аналита и внутреннего стандарта. В идеале в качестве внутренних стандартов следует использовать аналоги, содержащие [¹³C] (меченые углеродом-13) целевых аналитов, поскольку они элюируются точно одновременно при любых хроматографических условиях. Они также исключают возможность обмена дейтерия в протонных (содержащих воду) растворителях. Благодаря улучшенному хроматографическому разрешению, обеспечиваемому частицами размером менее 2 мкм, может происходить большее разделение аналитов и их соответствующих дейтериевых аналогов, что еще больше снижает эффективность внутреннего стандарта.

Клиническое значение: Что это означает для пациентов

Эти технические достижения — не просто академические упражнения; они имеют прямое отношение к уходу за пациентами. Для женщин в постменопаузе, принимающих ингибиторы ароматазы для лечения рака молочной железы, знание их истинного уровня эстрогена помогает онкологам определить, насколько эффективно действует препарат. Для детей, проходящих обследование по поводу раннего или задержанного полового созревания, точные измерения уровня эстрогена направляют решения о лечении, которые могут повлиять на рост и развитие.

Для пожилых мужчин уровень эстрогена все чаще признается релевантным для оценки риска рака предстательной железы и здоровья костей. А для женщин в постменопаузе точная оценка воздействия эстрогена имеет решающее значение для оценки риска развития рака молочной железы и выбора соответствующих профилактических стратегий.

Описанные в этом обзоре ультрачувствительные методы — особенно подход с дериватизацией NMPS, требующий всего 0,1 мл сыворотки, — позволяют проводить точные измерения на уровнях, ранее не поддававшихся обнаружению. Это открывает путь к более эффективному клиническому мониторингу и более надежным исследованиям того, как гормоны влияют на риск заболеваний на протяжении всей жизни. Возможность измерять 12 различных метаболитов эстрогена за один 45-минутный анализ из одной капли крови представляет собой значительное улучшение по сравнению с временами, когда для каждого эстрогена требовался отдельный иммуноанализ с сомнительной точностью.

Ограничения текущего подхода

Несмотря на эти достижения, остаются существенные ограничения. Во-первых, оценка матричных эффектов при анализе эстрогена усложняется тем, что подходящий пустой образец матрицы — образец, заведомо полностью лишенный эстрогенов, — не всегда доступен. Общий подход заключается в подготовке калибровочных стандартов и образцов контроля качества в суррогатных матрицах, таких как сыворотка, очищенная от липидов активированным углем. Однако процесс очистки активированным углем может удалять компоненты реальных образцов, вызывающие матричные эффекты, из-за чего калибровочные стандарты могут не полностью отражать состав реальных образцов пациентов.

Во-вторых, меченые изотопами внутренние стандарты — несмотря на свое название — не всегда могут идеально корректировать все источники вариаций, особенно если меченые дейтерием соединения сдвигаются по времени удерживания и испытывают иное подавление ионизации по сравнению с природными эстрогенами.

В-третьих, оценка эффективности гидролиза между образцами остается сложной из-за отсутствия аутентичных стандартов и стандартов, меченных стабильными изотопами, для всех конъюгированных форм. Сложность измерения неизмененных конъюгатов усугубляется крайне ограниченной коммерческой доступностью необходимых эталонных стандартов: в настоящее время доступен для покупки только один из пяти форм сульфата E2.

Наконец, ферментные препараты, используемые для гидролиза, могут вносить мешающие факторы. Широко применяемый фермент Helix pomatia загрязнен активностью 3β-HSD, что может создавать помехи, если в том же образце измеряются андрогены. Кроме того, концентрации некоторых неконъюгированных метаболитов эстрогена, циркулирующих в организме, ниже нижнего предела количественного определения даже этих передовых методов.

Рекомендации для исследователей и клиницистов

Основываясь на своем обширном опыте, авторы предлагают следующие практические рекомендации всем, кто проводит ультрачувствительный анализ эстрогена:

1. Предварительно тестируйте все расходные материалы: Пробирки, реактивы и ферменты следует предварительно тестировать, чтобы убедиться, что они не внесут загрязнение или помехи. Собственное открытие авторов о том, что стеклянные пробирки могут давать сигнал, эквивалентный эстрогену в концентрации 10 пг/мл, служит предостерегающим примером.
2. Используйте MTBE для жидкостной экстракции: Он продемонстрировал наиболее полное извлечение тестируемых стероидных гормонов по сравнению с диэтиловым эфиром, гексаном и 2-метилбутаном.
3. Выберите преионизированные производящие реагенты: Производные NMPS обеспечивают постоянный заряд, что позволяет достичь максимальной чувствительности (1,0 фг на колонке), при этом дериватизация происходит в группе фенольного гидроксила, что делает метод применимым ко всем эстрогенам.
4. Оптимизируйте хроматографическое разделение с использованием колонок с частицами размером менее 2 мкм: Они обеспечивают необходимое разрешение для разделения изомерных катехолов и метоксиэстрогенов, которые в противном случае могли бы привести к ошибкам завышения результатов.
5. Отдавайте предпочтение внутренним стандартам с меченым углеродом ¹³C: Они элюируются точно вместе с целевыми аналитами при любых хроматографических условиях, устраняя проблемы со смещением времени удерживания, связанные с дейтериевыми метками.
6. Рассмотрите возможность анализа неизмененных конъюгатов: Это полностью избегает проблем гидролиза, хотя в настоящее время ограничено доступностью стандартов конъюгатов.
7. Проведите тщательную валидацию метода: Подтвердите чувствительность, специфичность и воспроизводимость анализа до работы с клиническими образцами, следуя рекомендациям FDA с критериями приемлемости: смещение ±15% и коэффициент вариации (CV) ниже 15%.
8. Будьте в курсе ограничений матриц-суррогатов: Сыворотка, очищенная от липидов активированным углем, может не полностью имитировать реальные образцы пациентов, поэтому результаты следует интерпретировать с соответствующей осторожностью.

Эти рекомендации особенно актуальны для клинических лабораторий и исследовательских групп, работающих с образцами от пожилых мужчин, детей, женщин в постменопаузе и женщин, принимающих ингибиторы ароматазы, — популяций, где точное и сверхчувствительное измерение уровня эстрогена может напрямую влиять на диагноз, принятие решений о лечении и исходы для пациентов.

Часто задаваемые вопросы

Почему так сложно измерять уровень эстрогена у людей с очень низким его содержанием?

У таких групп, как женщины в постменопаузе, пожилые мужчины и дети, уровни эстрогена могут быть ниже 5 пикограммов на миллилитр, что часто в 100 раз ниже, чем у взрослых. Такие ничтожно малые количества трудно обнаружить, поскольку молекулы эстрогена неэффективно ионизируются в стандартных лабораторных приборах. Химики используют специальные химические модификации и сверхчувствительную масс-спектрометрию для их точного измерения.

Какие были основные проблемы со старыми тестами на эстроген (иммуноанализы)?

Старые тесты, использующие антитела, часто давали перекрёстную реактивность с похожими молекулами, что приводило к неточным показаниям. Результаты варьировались между лабораториями, и каждый тест мог измерять только один эстроген за раз. Измерение нескольких продуктов распада эстрогена требовало множества отдельных тестов, что делало процесс медленным и ненадежным для низких уровней.

Насколько точны современные методы масс-спектрометрии для тестирования на эстроген?

Современные методы, использующие разведение стабильными изотопами и жидкостную хроматографию–масс-спектрометрию, широко считаются золотым стандартом. Они обеспечивают лучшую специфичность, высокую точность и позволяют измерять несколько эстрогенов одновременно. Добавляя известное количество меченого эстрогена, ученые сравнивают сигналы для расчета точных естественных уровней, исправляя многие ошибки старых методов.

Что означает сверхчувствительный тест на эстроген для женщины, принимающей ингибиторы ароматазы?

Для женщин в постменопаузе с раком молочной железы, принимающих ингибиторы ароматазы, точное знание истинного уровня эстрогена помогает онкологам видеть, работает ли препарат. Старые тесты могли пропускать очень низкие уровни. Сверхчувствительное тестирование может измерять уровень эстрогена по одной капле крови, предлагая более надежный мониторинг эффективности лечения.

Почему точное измерение уровня эстрогена важно для детей с проблемами пубертата?

У детей, проходящих оценку на раннее или задержанное половое созревание, уровни эстрогена направляют решения о лечении, которые могут повлиять на рост и развитие. Уровни эстрогена у детей могут быть примерно в 100 раз ниже, чем у взрослых, что делает их трудными для измерения. Передовые методы теперь позволяют точно измерять уровень по очень небольшим образцам крови, помогая врачам оказывать соответствующую помощь.

Сколько крови нужно для сверхчувствительного тестирования на эстроген?

Некоторые передовые методы требуют всего 0,1 миллилитра сыворотки, что составляет примерно одну каплю крови. Например, метод, использующий дериватизацию N-метилпиридинием-3-сульфонил, достиг высокой чувствительности при использовании всего 0,1 мл. Более ранний метод требовал 0,5 мл. Меньшие требования к объему образца делают тестирование более удобным для детей и ослабленных пациентов.

Каковы преимущества новых методов тестирования на эстроген по сравнению со старыми?

Новые методы позволяют измерять до 12 различных метаболитов эстрогена за один 45-минутный анализ с использованием одной капли крови. Они обеспечивают значительно большую точность на очень низких уровнях, избегают проблем с перекрёстной реактивностью и дают надёжные результаты для выбора тактики лечения при таких состояниях, как рак молочной железы, нарушения пубертатного периода и оценка риска рака предстательной железы. Это улучшает клиническое наблюдение и научные исследования.

Стоит ли мне получить второе мнение по результатам анализа на эстроген, если я женщина в постменопаузе или мужчина старшего возраста с очень низким уровнем эстрогена?

Да, второе мнение может быть полезным, поскольку старые иммуноанализы часто давали неточные результаты из-за перекрёстной реактивности, а показатели варьировались между лабораториями. Современные методы масс-спектрометрии являются золотым стандартом и позволяют точно измерять очень низкие уровни эстрогена (менее 5 пг/мл) с использованием одной капли крови. Если ваш анализ проводился старым методом, второе мнение с применением современных технологий может дать более надёжные результаты, что важно для мониторинга терапии ингибиторами ароматазы или оценки риска развития рака. Diagnostic Detectives Network предоставляет независимые экспертные вторые мнения.

Информация об источнике

Эта статья для пациентов основана на рецензируемых научных исследованиях, опубликованных в Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.

Original article title: Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special populations in serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

Authors: Qingqing Wang, Clementina Mesaros, and Ian A. Blair

Publication details: J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 September; 162: 70–79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002 (Published in final edited form as an HHS Public Access author manuscript, available in PMC 2017 September 01)

Affiliations: Center of Excellence in Environmental Toxicology and Penn SRP Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania; Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing, China.

Примечание: Данная статья объясняет техническое содержание оригинального научного обзора языком, понятным пациентам. Она предназначена исключительно для образовательных целей и не является медицинской рекомендацией. Пациентам, имеющим вопросы по тестированию на эстроген или гормональным заболеваниям, следует проконсультироваться со своим лечащим врачом.