Недавние достижения в исследованиях стволовых клеток: от лабораторных открытий до применения у пациентов

Оглавление

• Ключевые моменты
• Введение
• Источники плюрипотентных стволовых клеток
• Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)
• Очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSEL)
• Стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSC)
• Репрограммированные стволовые клетки (RSC)
• Взрослые стволовые клетки
• Клинические применения и перспективы развития
• Этические соображения
• Часто задаваемые вопросы
• Информация об источнике

Ключевые моменты

• Стволовые клетки способны к самообновлению и дифференцировке в специализированные типы клеток из трех зародышевых листков.
• Существует пять основных типов стволовых клеток: эмбриональные, VSEL, полученные переносом ядра, репрограммированные и взрослые стволовые клетки.
• Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) могут быть получены из клеток взрослого организма, например, из образцов мочи.
• Стволовые клетки, полученные переносом ядра, использовались для клонирования приматов, что способствует исследованию заболеваний.
• В настоящее время проводятся клинические исследования по трансплантации сетчатки глаза и спинного мозга с использованием стволовых клеток.

Введение

За последние 20 лет исследования в области стволовых клеток претерпели революционные изменения, особенно быстрыми темпами развиваясь за последнее десятилетие. Эта область началась в 1961 году, когда канадские исследователи доктора Джеймс А. Тилл и Эрнест А. МакКаллох впервые обнаружили стволовые клетки в костном мозге мыши, способные дифференцироваться в различные типы клеток, что заложило концепцию плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) — клеток, способных превращаться в любой тип клеток организма.

В этой области были достигнуты несколько ключевых этапов: овца Долли была клонирована в 1996 году с помощью переноса ядра соматической клетки (SCNT), первые человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) были выделены в 1998 году, а индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) были созданы в 2006 году путем репрограммирования взрослых клеток с помощью всего четырех транскрипционных факторов. Важность этих открытий была признана, когда Синъя Яманака и Джон Гердон получили Нобелевскую премию 2012 года за свою работу, показавшую, что зрелые клетки могут быть репрограммированы в плюрипотентное состояние.

В ходе систематического обзора исследователи выделили пять основных категорий стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки (ESCs), очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSELs), стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSCs), репрограммированные стволовые клетки (RSCs) и взрослые стволовые клетки. Каждый тип обладает уникальными преимуществами и сложностями для клинического применения. Только NTSCs использовались для создания полноценного организма (обезьяны в Китае, 2018 г.), в то время как другие типы использовались для создания тканей и органов.

Стволовые клетки, особенно ЭСК и иПСК, демонстрируют огромный потенциал в четырех основных областях: регенеративной медицине и трансплантологии, моделировании заболеваний, скрининге при открытии новых лекарств и биологии развития человека. Эта область продолжает развиваться от первоначальных открытий к расширению клинических применений, хотя остаются определенные трудности — особенно в отношении контроля пролиферации и дифференцировки клеток, поскольку технология репрограммирования иПСК все еще относительно нова.

Источники плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) характеризуются двумя важными свойствами: самообновлением (способностью к пролиферации) и плюрипотентностью (способностью дифференцироваться в специализированные типы клеток, происходящие из одного из трех первичных зародышевых листков: эктодермы, энтодермы или мезодермы). Исследователи используют три основных метода для проверки плюрипотентности на моделях мышей.

Тест на тератомообразование оценивает спонтанное образование дифференцированных тканей из всех трех зародышевых листков после трансплантации клеток иммунодефицитным мышам. Тест на образование химер проверяет, вносят ли стволовые клетки вклад в развитие, путем их инъекции в ранние эмбрионы (бластоцисты 2N) и проверки наличия у донорских клеток способности к передаче по линии герминативных клеток, образованию функциональных гамет и сохранению хромосомной целостности. Тест на тетраплоидную комплементацию определяет способность плюрипотентных клеток формировать целый организм путем инъекции клеток в 4N-эмбрионы и мониторинга стадий роста для выявления внеэмбриональных линий, происходящих от трансплантированных стволовых клеток, а не от самого эмбриона.

Эмбриональные стволовые клетки (ESCs)

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) получают из бластоцист ранней стадии развития (4–5 дней после оплодотворения), либо разрушая исходную бластоцисту, либо забирая ткани более поздних стадий (до 3 месяцев гестационного возраста). Это были первые стволовые клетки, примененные в исследовательских целях, и они до сих пор широко используются в клинических испытаниях (как отслеживается на сайте clinicaltrials.gov).

hESCs являются золотым стандартом плюрипотентности, но их использование связано с этическими проблемами, касающимися разрушения эмбрионов, а также потенциальными проблемами иммунного отторжения при трансплантации пациентам. Несмотря на эти трудности, они продолжают давать ценные сведения в области биологии развития и служат важными объектами для сравнения с новыми технологиями в области стволовых клеток.

Очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSELs)

Новый тип плюрипотентных стволовых клеток, называемый очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSELs), демонстрирует многообещающие результаты с момента их идентификации в 2006 году. Более 20 независимых лабораторий подтвердили их существование, хотя некоторые группы ставили их достоверность под сомнение. Эти клетки представляют собой малые стволовые клетки раннего развития, обнаруженные в тканях взрослого организма, которые экспрессируют маркеры плюрипотентности.

ОМЭСК имеют размер примерно 3–5 мкм у мышей и 5–7 мкм у людей (чуть меньше эритроцитов). Они экспрессируют маркеры ЭСК, включая SSEA, ядерный Oct-4A, Nanog и Rex1, а также маркеры мигрирующих первичных половых клеток, такие как Stella и Fragilis. Их происхождение может быть связано с депозитами первичных половых клеток в развивающихся органах во время эмбриогенеза.

Согласно предложенной в 2019 году модели, ОМЭСК происходят из первичных половых клеток и дифференцируются в три возможных направления: мезенхимальные стволовые клетки (МСК), гемангиобласты (включая гемопоэтические стволовые клетки и эндотелиальные клетки-предшественники) и тканеспецифичные стволовые клетки. Как плюрипотентные стволовые клетки, ОМЭСК могут обладать преимуществом способности дифференцироваться по всем зародышевым листкам у взрослых животных или людей, потенциально функционируя как альтернатива монопотентным тканеспецифичным стволовым клеткам у взрослых.

VSELs могут решить ряд проблем, связанных с другими типами стволовых клеток: этические споры вокруг ESCs и риск образования тератом (опухолей) у iPSCs. Это делает их особенно перспективными для будущих исследований стволовых клеток и клинического применения в тех областях, где подобные проблемы создают значительные препятствия.

Стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSCs)

Изначально открытые в 1996 году, метод переноса ядра соматической клетки (SCNT) постепенно эволюционировал для получения стволовых клеток, полученных переносом ядра (СКПЯ). Этот процесс начинается с имплантации донорского ядра из полностью дифференцированной соматической клетки (например, фибробласта) в энуклеированную ооциту (яйцеклетку без ядра).

Затем яйцеклетка нового хозяина запускает генетическое перепрограммирование донорского ядра. В результате многочисленных митотических делений этой единственной клетки в культуре развивается бластоциста (около 100 клеток на ранней стадии эмбриона), что в конечном итоге приводит к появлению организма с ДНК, почти идентичной исходному организму — клона ядерного донора. Этот процесс может использоваться как для терапевтического, так и для репродуктивного клонирования.

Долли-овца (1996) стала первым успешным репродуктивным клоном млекопитающего. С тех пор было клонировано около двух десятков других видов. В январе 2018 года китайские ученые в Шанхае объявили об успешном клонировании двух самок макак с использованием фетальных фибробластов посредством SCNT — это были первые приматы, клонированные этим методом.

Создание клонированных приматов может произвести революцию в исследованиях заболеваний человека. Генетически однородные нечеловеческие приматы могут служить ценными животными моделями для изучения биологии приматов и биомедицинских исследований, помогая изучать механизмы заболеваний и мишени для лекарственных препаратов, одновременно снижая влияние генетической вариативности и сокращая количество необходимых лабораторных животных. Эта технология может сочетаться с геномным редактированием CRISPR-Cas9 для создания генетически модифицированных моделей приматов человеческих расстройств, таких как болезнь Паркинсона и различные виды рака.

Фармацевтические компании выразили высокую потребность в клонированных обезьянах для тестирования лекарственных препаратов. Вдохновленный этой перспективой, Шанхай уделил приоритетное внимание финансированию создания Международного центра исследований приматов для производства клонированных подопытных животных для международного использования. SCNT является уникальным методом среди подходов, связанных со стволовыми клетками, поскольку он позволяет создавать целый живой организм, а не просто слои клеток, тканей или фрагменты органов, что дает ему биофизиологические функциональные преимущества перед ESC и iPSCs как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения.

Репрограммированные стволовые клетки (РСК)

С 2006 года, когда Yamanaka и коллеги впервые получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), технологии репрограммирования значительно продвинулись вперед. Это особенно актуально для методов прямого репрограммирования как в лабораторных условиях (in vitro), так и внутри живых организмов (in vivo) для создания специфических тканевых линий с использованием факторов транскрипции, ограничивающих линию, модификаций РНК-сигналов, а также малых молекул или химических веществ.

Эти прямые подходы пропускают этап ИПСК, давая более точные клетки, такие как индуцированные нейральные прогениторные клетки (iNPC), которые ближе к целевым клеточным линиям, таким как нейральные клетки и последующие двигательные нейроны. Репрограммированные стволовые клетки (РСК) получаются путем применения любых лабораторных методов для репрограммирования генетических сигналов первичных клеток, исключая технику SCNT.

Чтобы преодолеть этические и иммуногенные проблемы, связанные с ЭСК человека (hESCs), ИПСК стали перспективной альтернативой, поскольку они получаются из взрослых соматических тканей. Источники человеческих ИПСК — кровь, кожа и моча — широко доступны. Поскольку hiPSC можно получить от отдельных пациентов, иммунное отторжение можно избежать при трансплантации обратно тому же пациенту (аутологичная трансплантация).

Исследователи разработали методы получения hiPSC из клеток почечных канальцев, присутствующих в моче. Протокол, требующий всего 30 мл образца мочи, прост, относительно быстр, экономически эффективен и универсален (применим к пациентам любого возраста, пола и расовой/этнической принадлежности). Общая процедура включает всего 2 недели культивирования клеток и 3–4 недели репрограммирования, обеспечивая высокий выход ИПСК с отличным потенциалом дифференцировки.

ИПСК, полученные из мочи, собранной из 200 мл чистых средних порций мочи посредством системы доставки на основе вируса Сендай, показали нормальный кариотип (хромосомную структуру) и продемонстрировали потенциал дифференцировки во все три зародышевых листка в тестах на тератомообразование. Подпопуляция клеток, выделенных из мочи, проявляла признаки клеток-предшественников, включая поверхностное клеточное экспрессирование маркеров c-Kit, SSEA4, CD105, CD73, CD91, CD133 и CD44, которые могут различать линии клеток мочевого пузыря (уротелиальные, гладкомышечные, эндотелиальные и интерстициальные), что делает их перспективным альтернативным источником клеток.

Взрослые стволовые клетки

Взрослые стволовые клетки представляют собой еще одну важную категорию стволовых клеток, обнаруженных в различных тканях по всему телу. В отличие от плюрипотентных стволовых клеток, они обычно являются мультипотентными — способными дифференцироваться в ограниченный набор типов клеток, специфичных для их ткани происхождения.

Распространенные источники включают костный мозг, жировую ткань, пульпу зубов и различные органы. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются одними из наиболее изученных взрослых стволовых клеток и показали перспективность в лечении воспалительных состояний, содействии восстановлению тканей и модуляции иммунных ответов.

Хотя они менее универсальны, чем плюрипотентные стволовые клетки, взрослые стволовые клетки предлагают преимущества, включая меньшие этические проблемы, более низкий риск образования опухолей и устоявшееся клиническое использование в процедурах, таких как трансплантация костного мозга. Исследования продолжают изучать их полный потенциал и механизмы действия.

Клинические применения и будущие направления

Исследования стволовых клеток прошли путь от фундаментальных исследований и доклинических исследований к теперь уже клиническим испытаниям в нескольких областях применения. Достижения в комбинациях факторов репрограммирования, экспериментальных методах и выяснении сигнальных путей способствовали проведению первых клинических испытаний для трансплантатов ретинальных клеток и трансплантатов спинного мозга.

В данной области по-прежнему решаются проблемы, связанные с контролем пролиферации и дифференцировки клеток. Исследователи систематически рассматривают такие методологические вопросы, как: индуцирование плюрипотентности с помощью геномных модификаций; создание новых векторов с факторами репрограммирования; стимуляция плюрипотентности iPSC с помощью малых молекул и генетических сигнальных путей; усиление репрограммирования с помощью microRNAs; индуцирование и усиление плюрипотентности iPSC с помощью химических веществ; получение специфических дифференцированных типов клеток; а также поддержание плюрипотентности iPSC и геномной стабильности.

Эти темы имеют решающее значение для максимизации эффективности получения и дифференцировки iPSC в рамках подготовки к клиническому применению. Достижения в области культивирования клеток включают бесфидерное культивирование, ксено-свободные среды (без использования продуктов животного происхождения) и различные методы с применением биоматериалов. Трехмерные (3D) технологии клеточного и биопринтинга представляют собой особенно перспективные направления, наряду с ресурсами PSC и прямым клеточным репрограммированием второго поколения в живых организмах.

Долгосрочные исследования стволовых клеток и клинические цели сосредоточены на разработке безопасных и эффективных методов лечения таких состояний, как нейродегенеративные заболевания, травмы спинного мозга, болезни сердца, диабет и многих других состояний, при которых замена клеток или регенерация тканей может принести терапевтическую пользу.

Этические соображения

Исследования стволовых клеток по-прежнему затрагивают важные этические вопросы, особенно в отношении эмбриональных стволовых клеток и технологий клонирования. Уничтожение человеческих эмбрионов для исследований hESC остается спорным во многих обществах и регулируется по-разному в разных странах.

Развивающиеся технологии, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), помогают решить некоторые этические проблемы, предоставляя альтернативные источники плюрипотентных клеток без разрушения эмбрионов. Однако возникают новые этические вопросы, касающиеся генетической модификации, согласия на донорство клеток и равного доступа к получаемым терапиям.

Международное научное сообщество продолжает разрабатывать руководства и нормативные акты, чтобы обеспечить этичное развитие исследований стволовых клеток, одновременно максимизируя потенциальную пользу для пациентов, страдающих от различных заболеваний и состояний.

Часто задаваемые вопросы

Какие существуют различные типы стволовых клеток?

В статье описаны пять основных категорий стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSELs), стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSCs), репрограммированные стволовые клетки (RSCs) и взрослые стволовые клетки. Каждый тип имеет уникальные источники и клинический потенциал. Например, ЭСК получают из бластоцист, тогда как iPSCs репрограммируют из взрослых клеток.

Можно ли использовать стволовые клетки для лечения заболеваний?

Да, стволовые клетки демонстрируют перспективы в регенеративной медицине, моделировании заболеваний и открытии новых лекарств. Клинические испытания проводятся при таких состояниях, как травмы сетчатки и спинного мозга. Однако остаются проблемы с контролем пролиферации и дифференцировки клеток. Взрослые стволовые клетки уже используются в трансплантации костного мозга, а iPSCs могут обеспечить персонализированную терапию.

Каковы этические проблемы, связанные с исследованиями стволовых клеток?

Этические проблемы в первую очередь связаны с разрушением человеческих эмбрионов для исследований эмбриональных стволовых клеток. Однако индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) предлагают альтернативу, которая избегает разрушения эмбрионов. Клонирование методом переноса ядра также вызывает этические вопросы. Регулирование варьируется от страны к стране, и текущие исследования направлены на решение этих проблем.

Как получают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) из организма пациента?

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) можно получить из крови, кожи или мочи пациента. Например, простая проба мочи объемом 30-ml обеспечивает почечные канальцевые клетки, которые культивируют в течение 2 недель, а затем перепрограммируют в течение 3-4 недель, чтобы они стали iPSCs. Этот метод экономически эффективен и подходит для пациентов всех возрастов и любого происхождения.

В чем заключаются преимущества использования собственных стволовых клеток пациента для лечения?

Использование собственных стволовых клеток пациента, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), полученных из его крови, кожи или мочи, предотвращает иммунное отторжение, поскольку эти клетки генетически идентичны пациенту. Этот подход аутологичной трансплантации устраняет необходимость в иммуносупрессивных препаратах и снижает риск отторжения трансплантата.

Каков риск образования опухолей при использовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток?

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) несут риск тератомообразования, которое является видом опухоли. Это известная проблема в данной области. Исследователи работают над контролем пролиферации и дифференцировки клеток, чтобы минимизировать этот риск до того, как iPSCs смогут безопасно применяться в клинической практике.

Как тестируют стволовые клетки, чтобы убедиться, что они могут превращаться в любой тип клеток?

Стволовые клетки тестируются на плюрипотентность с помощью трех основных методов на мышах. Тест на тератомообразование проверяет, могут ли клетки формировать ткани из всех трех зародышевых листков. Тест на образование химер проверяет, участвуют ли они в развитии и производят ли функциональные гаметы. Тест на тетраплоидную комплементацию определяет, могут ли они сформировать целый организм.

Стоит ли получать второе мнение перед лечением стволовыми клетками при таком состоянии, как травма спинного мозга или заболевание сетчатки?

Второе мнение может быть ценным перед лечением стволовыми клетками, поскольку эта область быстро развивается, и клинические испытания проводятся при таких состояниях, как травмы сетчатки и спинного мозга. Разные специалисты могут иметь различный опыт работы с пятью типами стволовых клеток, включая эмбриональные, индуцированные плюрипотентные и взрослые стволовые клетки. Второе мнение может помочь подтвердить, являетесь ли вы подходящим кандидатом для экспериментальной терапии, прояснить риски, такие как тератомообразование при использовании iPSCs, и убедиться, что вы понимаете альтернативы. Diagnostic Detectives Network предоставляет независимые экспертные вторые мнения.

Источник информации

Original Article Title: Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications

Authors: Gele Liu, Brian T. David, Matthew Trawczynski, Richard G. Fessler

Publication: Stem Cell Reviews and Reports (2020) 16:3–32

DOI: https://doi.org/10.1007/s12015-019-09935-x

Эта статья, адаптированная для пациентов, основана на рецензируемых исследованиях и призвана сделать сложную научную информацию доступной, сохраняя при этом все основные выводы и данные оригинальной публикации.