Понимание плюрипотентных стволовых клеток: понятное для пациентов руководство по науке, перспективам и достижениям

Оглавление

• Ключевые моменты
• Справочная информация: что такое плюрипотентные стволовые клетки?
• Как проводился данный обзор
• Ключевые вехи в истории изучения стволовых клеток
• Пять основных категорий стволовых клеток
• Как ученые проверяют плюрипотентность
• Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)
• Очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSEL)
• Стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSC), и клонирование
• Репрограммированные стволовые клетки (RSC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC)
• Подробнее: iPSC, полученные из мочи
• Клинические последствия и будущие применения
• Ограничения и этические соображения
• Дополнительные темы в оригинальном обзоре
• Рекомендации и надежды для пациентов
• Часто задаваемые вопросы
• Информация об источнике

Основные положения

• Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в любой из трех зародышевых листков: эктодерму, энтодерму и мезодерму.
• Индуктивные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из мочи, предлагают неинвазивный и простой способ создания стволовых клеток из образца объемом 30 мл.
• Терапия стволовыми клетками несет риски, включая тератомообразование, генетическую нестабильность и возможную иммунную отторжение.
• Только стволовые клетки, полученные переносом ядра, позволили сформировать полноценный организм, например, клонированных обезьян в 2018 году.
• Некоторые виды лечения стволовыми клетками, такие как трансплантация сетчатки и спинного мозга, уже находятся на ранних этапах клинических испытаний.

Введение: Что такое плюрипотентные стволовые клетки?

Плюрипотентные стволовые клетки — это «материнские клетки» организма. Они обладают двумя определяющими свойствами: самообновлением (способностью делиться и создавать новые стволовые клетки) и потенцией (способностью созревать в специализированные типы клеток).

Конкретно, эти клетки могут дифференцироваться в любой из трех первичных зародышевых листков, из которых формируются все ткани человека: эктодерму (кожа, мозг и нервная система), энтодерму (легкие, печень и пищеварительный тракт) и мезодерму (мышцы, кости и кровь). Эта невероятная гибкость делает плюрипотентные стволовые клетки мощным инструментом в медицине.

Как проводился этот обзор

Статья представляет собой систематический обзор, что означает, что авторы — исследователи из Медицинского колледжа Университета Раша в Чикаго — собрали, проанализировали и обобщили результаты множества опубликованных научных исследований. Вместо проведения одного нового эксперимента они рассмотрели существующие доказательства, чтобы предоставить «общую картину» исследований стволовых клеток. Обзор охватывает 15 ключевых направлений, начиная от источников плюрипотентных стволовых клеток и заканчивая современными этическими спорами.

Ключевые вехи в истории исследований стволовых клеток

Путь начался более полувека назад. В 1961 году доктора Джеймс А. Тилл и Эрнест А. МакКаллох из Университета Торонто в Канаде впервые описали стволовые клетки. Они обнаружили, что клетки из костного мозга мыши могут дифференцироваться в различные типы клеток, и назвали их плюрипотентными стволовыми клетками.

Несколько десятилетий спустя, в 1996 году, овца Долли стала первым млекопитающим, клонированным из взрослой клетки с помощью техники, называемой перенос ядра соматической клетки (SCNT). Это было сделано Китом Кэмпбеллом, Ианом Уилмотом и коллегами из Института Рослина в Шотландии. Создание Долли доказало, что генетический материал зрелой клетки можно «сбросить» до эмбрионального состояния.

В 1998 году Джеймс Томсон в США впервые выделил человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs). Затем, в 2006 году, произошло важное достижение: Синъя Яманака и его коллеги получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) из взрослых клеток путем их репрограммирования с помощью всего четырех основных транскрипционных факторов — Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Это достижение было примечательным тем, что изначально было протестировано всего 24 кандидата, и только четыре из них оказались необходимыми. В 2012 году Яманака и Джон Гердон получили Нобелевскую премию по физиологии или медицине за свое открытие о том, что зрелые клетки могут быть репрограммированы в плюрипотентное состояние.

С тех пор исследования стволовых клеток расцвели как захватывающая и многообещающая область, где ученые обнаружили врожденные взрослые стволовые клетки в нескольких органах и разработали все более передовые технологии.

Пять основных категорий стволовых клеток

После систематического обзора исследований авторы предлагают классифицировать все стволовые клетки по пяти основным категориям. Каждый тип имеет уникальное происхождение, метод получения и потенциальное применение в медицине:

1. Эмбриональные стволовые клетки (ESCs): Получены из ранних стадий эмбрионов (бластоцист).
2. Очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (VSELs): Крошечные примитивные клетки, обнаруженные во взрослых тканях.
3. Стволовые клетки, полученные переносом ядра (СКПЯ): Создаются путем переноса ядра донорской соматической клетки в яйцеклетку, из которой было удалено собственное ядро.
4. Репрограммированные стволовые клетки (РСК): Взрослые клетки, которые были генетически «отмотаны назад» в лабораторных условиях (включают иПСК).
5. Взрослые стволовые клетки (ВСК): Тканеспецифичные стволовые клетки, обнаруженные в организме.

Согласно обзору, только СКПЯ использовались для получения полноценного организма—в Китае в 2018 году из СКПЯ были выращены обезьяны. ЭСК, иПСК и взрослые стволовые клетки на данный момент использовались для получения тканей и органов, но не целых животных.

Как ученые проверяют плюрипотентность

Чтобы подтвердить, что стволовая клетка действительно является плюрипотентной, исследователи используют три основных теста in vivo (в живом организме) на мышах, как обобщил Aoi (2016):

• Тест на тератомообразование: Стволовые клетки трансплантируют иммунодефицитным мышам, и ученые проверяют, образуют ли клетки спонтанно дифференцированные ткани из всех трех зародышевых листков. Это доказывает, что клетки могут превращаться во многие типы клеток.
• Тест на образование химер: Стволовые клетки вводят в эмбрионы ранней стадии развития (так называемые 2N бластоцисты). Полученные «химеры» затем скрещивают. Если донорские клетки вносят вклад в половую линию — то есть могут производить функциональные сперматозоиды или яйцеклетки — и сохраняют нормальный набор хромосом, клетки обладают «функциональной плюрипотентностью».
• Тест на тетраплоидную комплементацию (4N): Это самый строгий тест. Стволовые клетки вводят в 4N эмбрионы (тетраплоидные бластоцисты). Если тестируемые клетки способны сформировать весь организм — включая сам эмбрион, тогда как тетраплоидный эмбрион вносит вклад только во внеэмбриональные ткани — клетки являются истинно плюрипотентными.

Эти тесты необходимы для определения того, является ли новая линия стволовых клеток безопасной и полезной для будущей терапии.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) получают из бластоцист ранней стадии развития — примерно через 4–5 дней после оплодотворения, разрушая исходную бластоцисту. Их также можно получить из тканей более поздних стадий развития (до 3 месяцев гестационного возраста или менее). чЭСК были первыми стволовыми клетками, использованными в исследованиях, и до сих пор широко применяются в клинических испытаниях, как указано на сайте clinicaltrials.gov.

Однако, поскольку их получение требует разрушения человеческих эмбрионов, чЭСК вызывают серьезные этические опасения. Эти опасения являются одной из главных причин, по которым ученые работают над созданием альтернативных источников плюрипотентных клеток.

Очень малые эмбрионоподобные стволовые клетки (ОМЭСК)

ОМЭСК были идентифицированы в 2006 году Ратайчаком и коллегами. С тех пор более 20 независимых лабораторий подтвердили их существование, хотя несколько групп все еще ставят это под сомнение.

Как следует из их названия, эти клетки очень малы — около 3–5 микрометров у мышей и 5–7 микрометров у людей (чуть меньше эритроцитов). Они обнаруживаются во взрослых тканях и разделяют некоторые маркеры с эмбриональными стволовыми клетками, такие как SSEA, ядерный Oct-4A, Nanog и Rex1. Они также экспрессируют маркеры, характерные для мигрирующих первичных половых клеток (клеток, из которых образуются яйцеклетки или сперматозоиды), такие как Stella и Fragilis.

Согласно модели Ратайчака 2019 года, ОМЭСК происходят из первичных половых клеток (ППК) и могут дифференцироваться в три возможных направления:

• Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — поддерживают восстановление тканей
• Гемангиобласты — которые включают гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП), помогая формировать кровь и кровеносные сосуды
• Тканеспецифичные стволовые клетки (ТССК) — клетки, готовые стать определенными тканями

Поскольку VSELs обнаруживаются в тканях взрослых, они могут избегать этических проблем, связанных с эмбриональными стволовыми клетками, а также, вероятно, реже образуют тератомы (опухоли), чем индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. По этим причинам они считаются перспективной альтернативой для будущих методов лечения с использованием стволовых клеток.

Стволовые клетки, полученные переносом ядра (NTSCs) и клонирование

Техника переноса ядра соматической клетки (SCNT) впервые была успешно реализована на овце Долли в 1996 году. Процесс начинается с взятия полностью дифференцированной взрослой клетки (например, фибробласта) и помещения ее ядра, содержащего ДНК, в яйцеклетку, из которой было удалено собственное ядро. Яйцеклетка затем «перепрограммирует» донорское ядро так, чтобы оно функционировало как ранний эмбрион. После нескольких делений клетка развивается в бластоцисту, состоящую примерно из 100 клеток, и в конечном итоге может вырасти в организм, который является почти идентичным клоном исходного донора.

Эта техника может использоваться для двух целей:

• Репродуктивное клонирование: создание целого живого животного.
• Терапевтическое клонирование: получение стволовых клеток для медицинского лечения.

С момента появления Долли было клонировано около двух десятков других видов. В январе 2018 года ученые из Шанхая, Китай, объявили об успешном использовании фетальных фибробластов для клонирования двух самок макак — первых приматов, когда-либо клонированных с помощью SCNT.

Почему это важно для пациентов? Клонирование приматов может помочь создать генетически однородные модели животных, которые тесно имитируют человеческие заболевания. Это облегчит изучение механизмов заболеваний и тестирование новых лекарств, сокращая количество необходимых животных. Его также можно комбинировать с редактированием генома CRISPR-Cas9 для создания моделей приматов человеческих нарушений, таких как болезнь Паркинсона и различные виды рака. Фармацевтические компании уже проявили высокий интерес к клонированным обезьянам для тестирования лекарств, а город Шанхай финансирует Международный центр исследований приматов для производства этих животных для использования по всему миру.

Особенным преимуществом NTSCs является то, что они могут генерировать целый живой организм, тогда как эмбриональные стволовые клетки (ESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) обычно используются для выращивания слоев клеток, тканей или фрагментов органов. С биофизической точки зрения это дает SCNT уникальное преимущество в фундаментальных исследованиях и клинических применениях.

Репрограммированные стволовые клетки (RSCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs)

С момента знаменитого открытия Яманаки в 2006 году технологии перепрограммирования значительно продвинулись вперед. Исследователи теперь могут напрямую преобразовывать один тип взрослых клеток в другой с помощью транскрипционных факторов, ограниченных линией развития (белков, включающих специфические гены), модификаций РНК-сигналов и малых молекул или химических веществ. Это называется «прямым перепрограммированием».

Прямое перепрограммирование может полностью обойти стадию iPSC, производя клетки, которые уже близки к целевому типу клеток. Одним из примеров является создание индуцированных нейральных прогениторных клеток (iNPCs), которые затем могут превращаться в нейроны и двигательные нейроны. Эти клетки образуются путем экспрессии транскрипционных факторов, важных для развития нервной системы, предлагая более быстрый и потенциально более безопасный путь создания клеток для лечения травм спинного мозга или неврологических заболеваний.

Репрограммированные стволовые клетки (RSCs) включают все стволовые клетки, созданные вручную в лабораторных условиях путем «переписывания» генетических сигналов первичных клеток, за исключением SCNT, который классифицируется отдельно.

Ближе к делу: iPSCs, полученные из мочи

Одним из самых удобных для пациентов достижений является возможность создания iPSCs из мочи. Этот метод был впервые описан Чжоу и коллегами в июле 2011 года, а более подробный протокол опубликован годом позже. Он имеет несколько основных преимуществ:

• Неинвазивность: Не требуются иглы или хирургическое вмешательство.
• Простота и скорость: Весь процесс занимает около 2 недель культивирования клеток, за которыми следует 3–4 недели перепрограммирования.
• Дешевизна и универсальность: Для этого требуется всего 30 мл образца мочи, и он подходит для пациентов всех возрастов, полов и расово-этнических групп.
• Высокий выход и отличный потенциал дифференцировки: В исследовании с использованием 200 мл чистой мочи средней струи и системы доставки на основе вируса Сеная iPSCs, полученные из мочи, показали нормальный кариотип (нормальную структуру хромосом) и способность дифференцироваться во все три зародышевых листка в тесте на тератомообразование.

Как сообщали Чжан и коллеги, моча также содержит субпопуляцию клеток с признаками прогениторов. Эти клетки экспрессируют такие маркеры, как c-Kit, SSEA4, CD105, CD73, CD91, CD133 и CD44, что может помочь различать линии клеток мочевого пузыря (уротелиальные, гладкомышечные, эндотелиальные и интерстициальные клетки). Это означает, что моча может служить ценным и легкодоступным источником клеток для создания ткани мочевого пузыря или других урологических терапий.

Клиническое значение и будущие применения

Стволовые клетки — особенно ЭСК и ИПСК — обладают огромным потенциалом в четырех основных областях:

1. Регенеративная медицина и трансплантация: Замена поврежденных тканей или органов, таких как сердечная мышца после инфаркта, клетки сетчатки при макулярной дегенерации или нейрональные клетки при травме спинного мозга.
2. Моделирование заболеваний: Создание в пробирке клеток, несущих генетические мутации пациента, что позволяет ученым более точно изучать такие заболевания, как болезнь Паркинсона или рак.
3. Открытие и скрининг лекарств: Тестирование новых препаратов на клетках, полученных от конкретного пациента, чтобы определить, какие из них наиболее эффективны и безопасны, еще до начала клинических испытаний на людях.
4. Биология развития человека: Понимание того, как одна оплодотворенная яйцеклетка развивается в сложный организм, что может помочь выявить причины врожденных пороков и выкидышей.

В обзоре подчеркивается, что эти применения уже переходят от «фундаментальных исследований» к «доклиническим исследованиям», а в некоторых случаях — к ранним клиническим испытаниям, таким как трансплантация клеток сетчатки и спинного мозга.

Ограничения и этические аспекты

Несмотря на огромные перспективы, остаются некоторые проблемы:

• Риск тератомы: Как ЭСК, так и ИПСК могут образовывать тератомы (опухоли), если после трансплантации остаются недифференцированные клетки. Это серьезный барьер безопасности, который необходимо преодолеть перед широким клиническим применением.
• Генетическая нестабильность: ИПСК могут приобретать генетические мутации в процессе репрограммирования или при длительном культивировании. Поддержание геномной стабильности имеет критическое значение для безопасности пациентов.
• Иммунное отторжение: Даже при использовании ИПСК, полученных от самого пациента, могут наблюдаться тонкие иммунные различия. Однако, поскольку ИПСК можно получить непосредственно у пациента, риск отторжения значительно снижается по сравнению с донорскими клетками.
• Этические вопросы: Использование человеческих эмбрионов для получения ЭСК остается этически спорным. Клонирование приматов также поднимает серьезные этические вопросы о благополучии животных и потенциальном будущем применении клонирования к людям. В обзоре подчеркивается, что этические дискуссии должны поспевать за научными достижениями.
• Научный скептицизм: Как и в случае с VSEL, некоторые результаты исследований стволовых клеток все еще вызывают споры. Воспроизводимость и независимое подтверждение имеют решающее значение.

Дополнительные темы оригинального обзора

Полный обзор также охватывает несколько продвинутых тем, которые были выделены в аннотации, но не подробно рассмотрены в приведенном здесь тексте резюме. К ним относятся:

• Прямое репрограммирование in vivo нового поколения: Концепция прямого превращения клеток внутри организма, а не в лабораторной пробирке.
• Типы клеток, полученные из ПСК, и генетическая память: Как дифференцированные клетки сохраняют «память» о своем исходном состоянии, что может влиять на их поведение.
• Индукция плюрипотентности с помощью генетических модификаций: Использование генной инженерии для того, чтобы помочь клеткам вернуться в плюрипотентное состояние.
• Создание векторов с комбинациями факторов репрограммирования: Разработка более безопасных и эффективных систем доставки (таких как вирусы или эпизомы) для переноса факторов Яманаки.
• Повышение плюрипотентности с помощью малых молекул и генетических сигнальных путей: Использование препаратов или химических веществ, влияющих на такие пути, как ERK, MAPK, MEK, GSK3, BMP, TGF и FGF, для улучшения репрограммирования.
• Индукция клеточного репрограммирования с помощью РНК-сигнализации: Использование микроРНК или других молекул РНК для запуска репрограммирования без изменения самой ДНК.
• Индукция и повышение плюрипотентности с помощью химических веществ: Подбор химических коктейлей, которые могут полностью заменить генетические факторы.
• Поддержание плюрипотентности и геномной стабильности: Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) таким образом, чтобы сохранять их стабильность и жизнеспособность.
• Культуры без питательного слоя и ксеногенные культуры: Выращивание стволовых клеток без использования мышиных клеток (питательного слоя) или продуктов животного происхождения, что необходимо для получения клеток, пригодных для трансплантации человеку.
• Применение биоматериалов: Использование каркасов и других материалов для поддержки роста и организации стволовых клеток.
• Трехмерные (3D) клеточные технологии и 3D-биопечать: Выращивание клеток в трехмерных структурах и использование принтеров для послойного создания сложных тканей.
• Актуальные этические вопросы: Текущие дискуссии об использовании эмбрионов, клонировании и о том, как ответственно переводить науку о стволовых клетках в медицину.

Рекомендации и надежды для пациентов

Для пациентов и семей, интересующихся терапией стволовыми клетками, данный обзор предлагает несколько ключевых выводов:

• Уточняйте информацию о клинических испытаниях: Некоторые методы лечения на основе стволовых клеток, такие как трансплантация клеток сетчатки и спинного мозга, уже находятся на ранних этапах клинических испытаний. Всегда консультируйтесь с врачом относительно законных и одобренных вариантов.
• Будьте осторожны с непроверенными клиниками: В обзоре отмечается, что, несмотря на большой интерес к этой области, многие продукты все еще находятся на экспериментальной стадии. Ищите информацию в авторитетных медицинских центрах и официальных реестрах, таких как clinicaltrials.gov.
• Рассмотрите возможность сдачи биологических образцов: Простые образцы, такие как кровь или моча, можно использовать для создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) для исследований. Участие в исследовательских биобанках может способствовать ускорению открытий.
• Будьте в курсе событий: Наука о стволовых клетках развивается очень быстро. Следите за обновлениями из рецензируемых журналов и групп защиты прав пациентов.

Авторы обзора считают, что при продолжении исследований технологии на основе стволовых клеток в конечном итоге предложат новые методы лечения заболеваний, которые в настоящее время не поддаются лечению. Дальнейший путь требует сотрудничества между учеными, клиницистами, регуляторами и пациентами — а также приверженности как инновациям, так и этической ответственности.

Часто задаваемые вопросы

Что такое плюрипотентные стволовые клетки?

Плюрипотентные стволовые клетки — это главные клетки организма. Они способны к самообновлению, то есть делятся для создания новых стволовых клеток, и обладают плюрипотентностью, то есть могут дифференцироваться во многие специализированные типы клеток. В частности, они могут превращаться в любой из трех первичных зародышевых листков, из которых формируются все ткани человека: эктодерму, энтодерму и мезодерму.

Как получают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) из мочи?

ИПСК, полученные из мочи, создаются на основе небольшого образца мочи, обычно объемом 30 мл. Процесс является неинвазивным, простым и быстрым: около 2 недель культивирования клеток followed by 3–4 недели репрограммирования. Этот метод подходит для пациентов любого возраста, пола и происхождения, а полученные клетки способны дифференцироваться во все три зародышевых листка.

В чем разница между эмбриональными стволовыми клетками и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками?

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из бластоцист раннего развития, примерно на 4–5 день после оплодотворения, и их получение приводит к разрушению эмбриона. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) — это взрослые клетки, которые перепрограммируют в лаборатории, например с помощью четырех транскрипционных факторов. иПСК позволяют избежать необходимости разрушать эмбрионы и могут быть получены из собственных клеток пациента.

Каковы риски лечения стволовыми клетками?

Как эмбриональные, так и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут образовывать тератомы (опухоли), если после трансплантации остаются недифференцированные клетки. Кроме того, у иПСК во время перепрограммирования или при длительном культивировании могут возникать генетические мутации. Возможно также слабое иммунное отторжение, хотя использование иПСК, полученных из клеток самого пациента, значительно снижает этот риск. Многие методы лечения все еще находятся на экспериментальной стадии.

Доступны ли сейчас пациентам терапии стволовыми клетками?

Некоторые методы лечения на основе стволовых клеток, такие как трансплантация клеток сетчатки и спинного мозга, уже проходят ранние клинические испытания. Всегда консультируйтесь со своим врачом насчет законных и одобренных методов лечения и получайте информацию из авторитетных медицинских центров или официальных реестров, таких как clinicaltrials.gov. Будьте осторожны с непроверенными клиниками, так как многие продукты все еще находятся на экспериментальной стадии.

Что такое перенос ядра соматической клетки (SCNT) и почему это важно?

Перенос ядра соматической клетки — это метод, при котором ядро взрослой клетки помещают в яйцеклетку, из которой было удалено ее собственное ядро. Яйцеклетка перепрограммирует донорское ядро так, чтобы оно функционировало как эмбрион. Этот метод был впервые успешно применен на овце по имени Долли в 1996 году и может использоваться для репродуктивного клонирования или терапевтического клонирования.

Как ученые проверяют, является ли стволовая клетка истинно плюрипотентной?

Ученые используют три основных теста на мышах. Тест на тератомообразование проверяет, образуют ли трансплантированные клетки ткани из всех трех зародышевых листков. Тест на образование химер проверяет, вносят ли клетки вклад в формирование половой линии у ранних эмбрионов. Тест на тетраплоидную комплементацию является самым строгим: если тестируемые клетки способны сформировать весь организм, они истинно плюрипотентны.

Стоит ли получать второе мнение перед прохождением терапии стволовыми клетками при таком заболевании, как болезнь Паркинсона, или травме спинного мозга?

Да, получение второго мнения рекомендуется, поскольку многие методы лечения стволовыми клетками все еще находятся на экспериментальной стадии. Хотя некоторые терапии, такие как трансплантация клеток сетчатки и спинного мозга, проходят ранние клинические испытания, другие не имеют достаточных доказательств эффективности. Риски включают образование тератом, генетическую нестабильность и иммунное отторжение. Второе мнение поможет подтвердить, является ли предлагаемое лечение законным, и целесообразно ли рассмотреть варианты участия в клинических испытаниях. Diagnostic Detectives Network предоставляет независимые экспертные вторые мнения.

Информация об источнике

Эта статья для пациентов основана на следующей рецензируемой научной статье:

Original title: Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications

Authors: Gele Liu, Brian T. David, Matthew Trawczynski, Richard G. Fessler

Journal: Stem Cell Reviews and Reports (2020) 16:3–32

Published online: 23 November 2019

DOI: https://doi.org/10.1007/s12015-019-09935-x

Affiliation: Department of Neurosurgery, Rush University Medical College, Chicago, IL, USA

Примечание: Эта статья для пациентов основана на рецензируемых исследованиях и содержит прямые ссылки на данные и выводы оригинальной публикации. Для получения полной информации, пожалуйста, обратитесь к оригинальной статье.